SchimmelAntigenDetect - Validierung von pilzspezifischen Nachweisverfahren Enzyme-Linked ImmunoSorbet Assay (ELISA) - Korrelation mit Zellzahl (Mikroskopie, qPCR) und Kolonie bildenden Einheiten (KBE) unter kontrollierten, reproduzierbaren Bedingungen

Status:

abgeschlossen

Zielsetzung:

Bioaerosole an Arbeitsplätzen können bei hohen Konzentrationen und wiederholter Exposition zu schweren Erkrankungen bei Beschäftigten führen. Um die Exposition zu bestimmen und Schutz- bzw. Reduktionsmaßnahmen zu evaluieren, ist eine Sammlung und Detektion erforderlich. Verschiedene Nachweismethoden haben unterschiedliche Stärken, Schwächen, Nachweisgrenzen und Spezifitäten.

Ziel der Studie "SchimmelAntigenDetect" war die Evaluierung von sechs vom Institut für Prävention und Arbeitsmedizin (IPA) in Bochum entwickelten für Schimmelpilzantigene spezifischen Nachweisverfahren (ELISA) mit Luftstaubproben.

Aktivitäten/Methoden:

Für die Evaluierung waren unterschiedliche Konzentrationen an Schimmelpilzen nötig (Nachweisgrenzen). Die Spezifität wurde einerseits bereits in Publikationen gezeigt, andererseits in dieser Studie auch anhand von Misch- und Betriebsproben getestet. Um die ELISA zu testen und Referenzen zu den Konzentrationen der Proben zu erhalten, wurden die Proben jeweils mit vier Analyseverfahren ausgewertet. Die ELISA wurden mit mikroskopischer Sporenzählung, Bestimmung der koloniebildenden Einheiten und Erhebung der SSU-Kopienzahl (qPCR) als Analyseverfahren verglichen.

Die Luftstaubproben wurden mittels Filtration – GSP 10L Sammeleinheit mit Gilian 10i Pumpen und Teflonfiltern – gesammelt. In einer Bioaerosolkammer wurden unter kontrollierten Bedingungen Sporenaerosole von A. amoenus, A. amstelodami, A. fumigatus, C. herbarum, P. chrysogenum und W. sebi als Reinkulturen oder als Mischung hergestellt. Für die Aerosolerzeugung von fünf Konzentrationen je Organismus wurden zwei Aerosolgeneratoren (LSA, RBG) verwendet. Für die Analyse mittels ELISA wurden zwei Extraktionsverfahren, mit und ohne Zellaufschluss, getestet. Im komplementären Projekt "AntigenSampling" wurden Betriebsproben in Österreich genommen. Auch diese wurden mit den vom IPA entwickelten ELISA und den anderen drei Analyseverfahren ausgewertet. Im Projekt konnten für fünf der sechs Testorganismen fünf Konzentrationen im Bioaerosoltestsystem hergestellt werden. Für die hohen Konzentrationen wurde dafür ein davor noch nicht für Sporen getesteter Aerosolgenerator eingesetzt (RBG1000). Da A. fumigatus ein Risikogruppe-2-Organismus ist und für die Herstellung von Staub spezielle Geräte nötig sind, die nicht im Level-2-Labor vorhanden waren, wurden für diesen Organismus nur drei Konzentrationen getestet. Die Mischproben wurden aus fünf Organismen in vier Konzentrationen hergestellt. Je Organismus und Konzentration wurden mindestens fünf Filter beaufschlagt.

Ergebnisse:

Der Vergleich der gleichzeitig beaufschlagten Filter zeigt stabile Bedingungen im Testsystem, jedoch bereits hohe Schwankungen bei den Ergebnissen der qPCR. Die Auswertung mit koloniebildenden Einheiten (KBE), Sporenzählung und ELISA lieferten stabile Replikate. Dieses Ergebnis ist auch beim direkten Vergleich der Analyseverfahren zueinander und der Berechnung der Korrelationskoeffizienten ersichtlich. Die vom IPA entwickelten ELISA zeigten die höchste Übereinstimmung mit der Sporenzahl, gefolgt von den KBE. Bei der Sensitivität zeigen KBE die geringste Nachweisgrenze bei hoher Keimrate nach Flüssigkultivierung. Die Nachweisgrenze der ELISA-Assays hing von der Sporengröße ab; während große Sporen ab einer Sporenzahl von 10²/mL im messbaren Bereich lagen, waren für kleine Sporen bis zu 10⁶ Sporen/mL nötig. Die Extraktion mittels Zellaufschluss zeigte für die meisten Organismen keinen positiven Einfluss auf die Nachweisgrenze. Die Auswertung der Mischproben zeigt, dass die ELISA gut in der Lage waren die verschiedenen Pilze voneinander zu unterscheiden. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Übereinstimmung mit den KBE. Auch in an Arbeitsplätzen gesammelten Proben konnte sowohl mit den ELISA, als auch mit qPCR-Assays das Vorhandensein der Antigene bzw. Gene der verschiedenen Pilzspezies nachgewiesen werden. Zusammenfassend befinden die Autoren, dass die vom IPA entwickelten, pilzspezifischen ELISA eine sehr gute Ergänzung zu klassischen Methoden darstellen und ein Einsatz auf Arbeitsplätzen befürwortet wird. Die im Vergleich zu KBE relativ hohe Nachweisgrenze bei bestimmten kleinen Sporen und damit geringere Sensitivität sollte in Betracht gezogen und eine Kombination von Analyseverfahren eingesetzt werden. Der gemeinsame Einsatz mit routinemäßigen durchgeführten, sensitiven Methoden wie z. B. KBE würde eine große analytische Breite abdecken und die Spezifität und damit die Aussagekraft der Daten erhöhen.

Stand: